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Jun 18, 2023

Un metodo semplice per creare, intrappolare e deformare una vescicola in un gel

Scientific Reports volume 13,

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 5375 (2023) Citare questo articolo

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Presentiamo un metodo semplice per produrre pseudo-vescicole lipidiche giganti (vescicole con un cappuccio oleoso sulla parte superiore), intrappolate in un gel di agarosio. Il metodo può essere implementato utilizzando solo una normale micropipetta e si basa sulla formazione di una doppia goccia acqua/olio/acqua nell'agarosio liquido. Caratterizziamo la vescicola prodotta con imaging a fluorescenza e stabiliamo la presenza e l'integrità del doppio strato lipidico mediante l'inserimento riuscito delle proteine ​​transmembrana \(\alfa \)-emolisina. Infine, mostriamo che la vescicola può essere facilmente deformata meccanicamente, in modo non intrusivo, incidendo la superficie del gel.

Le vescicole sono state ampiamente utilizzate per imitare la compartimentazione cellulare e riprodurre funzioni biologiche specifiche in vitro con approcci dal basso verso l'alto1,2. In molti studi recenti, l'attenzione è stata posta sull'incapsulamento di complesse reazioni biologiche all'interno delle vescicole, per esprimere proteine3 o geni4, oppure per ricostituire e studiare i filamenti proteici del citoscheletro, come la corteccia di actina5 o gli astri dei microtubuli6. Molti altri lavori mirano a imitare le proprietà della membrana cellulare, come ad esempio la fusione della membrana7,8,9, o la comunicazione cellulare, tramite l'inserimento di proteine ​​transmembrana nei liposomi. In particolare, nella membrana dei liposomi sono stati inseriti canali meccanosensibili10,11, consentendo a loro volta di misurarne la conduttanza sotto stress meccanico.

La produzione di vescicole si basa solitamente su metodi di idratazione o modelli di emulsione invertita. I metodi di idratazione si basano sul rigonfiamento dei film lipidici essiccati in un tampone acquoso12,13. Sono relativamente semplici da utilizzare ma producono vescicole di dimensioni polidisperse e un'efficienza di incapsulamento relativamente non omogenea14,15,16. La velocità di produzione delle vescicole unilamellari può essere migliorata utilizzando campi elettrici (metodi di elettroformazione17) ma le proteine ​​fragili possono essere danneggiate dai campi applicati18,19 e la tecnica è anche limitata a tamponi con basse concentrazioni ioniche. I modelli di emulsione invertita, invece, si basano sul passaggio forzato di goccioline di emulsione acqua in olio attraverso un'interfaccia acqua/olio5,20. Questo metodo può essere sviluppato in chip microfluidici21,22,23,24, ottenendo dimensioni di vescicole monodisperse, limitate dalle dimensioni del canale microfluidico.

In entrambi i metodi (idratazione o emulsioni), le vescicole risultanti vengono disperse nel mezzo esterno, il che richiede passaggi aggiuntivi per gestirle o trasferirle in ambienti diversi (micropipette25, intrappolamento ottico26, ecc.). Questi passaggi aggiuntivi, che fanno affidamento su competenze tecniche specifiche, rendono difficile replicare molti esperimenti e raccogliere statistiche di grandi dimensioni sulle proprietà dei sistemi. In particolare, per studiare i processi di meccanotrasduzione è necessario stimolare meccanicamente le vescicole. In pratica, ciò è stato tipicamente ottenuto con deformazioni locali della membrana (aspirazione della pipetta27, flussi di fluidi28,29, AFM30,31). Tuttavia, questi metodi non riproducono fedelmente la natura delle perturbazioni meccaniche nei tessuti. Inoltre, trascurano l’accoppiamento meccanico tra le cellule e il loro ambiente biologico viscoelastico.

Proponiamo qui una nuova tecnica, che fornisce una piattaforma versatile per la produzione diretta di pseudo-vescicole biomimetiche (una vescicola con un cappuccio oleoso sulla parte superiore), ma consente anche la loro intrappolamento e l'eccitazione meccanica non intrusiva.

(a–f) (riga superiore) Schizzo del metodo di produzione della doppia emulsione. I colori verde/arancione/blu indicano rispettivamente le fasi interna/olio/esterna. (riga inferiore) Immagini in campo chiaro. Barre della scala = 500 \(\mu \)m. La gocciolina della doppia emulsione prodotta in (f) sedimenta nell'agarosio liquido e alla fine rimane intrappolata mentre l'agarosio gelifica. Contemporaneamente, il guscio d'olio circostante si crema nella parte superiore della goccia e un doppio strato lipidico viene compresso nella parte inferiore. Pochi minuti dopo, la pseudovescicola si è formata ed è intrappolata nel gel, come illustrato in (g). Pannello inferiore: immagine al macroscopio a fluorescenza di una pseudo-vescicola caricata con carbossifluoresceina intrappolata in un gel di agarosio. Barra della scala = 200 \(\mu \)m.